Гост лейкоз крупного рогатого скота

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Департамента
ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации
М.В.Кравчук 23 августа 2000 г. N 13-7-2/2130

1.
Общие положения

1.1. Лейкоз крупного
рогатого скота — хроническая инфекционная болезнь, вызываемая
вирусом лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Лейкозом болеет
крупный рогатый скот всех возрастов. Клинически болезнь проявляется
чаще у животных в возрасте старше 4 лет.

Болезнь протекает вначале
бессимптомно, затем проявляется персистентным лимфоцитозом и (или)
образованием опухолевидных разрастаний в кроветворных и других
органах и тканях.

После установления
опухолевой природы лейкоза болезнь как у животных, так и у человека
получила название гемобластозы, то есть опухолевые заболевания
крови. По характеру и месту локализации опухолевых разрастаний, а
также по морфологии и принадлежности пролиферирующих клеток к
определенным росткам гемопоэза гемобластозы разделены на две
группы:

лейкозы — системные
поражения органов кроветворения, включающие лимфоидную, миелоидную,
моноцитарную и недифференцированную формы;

гематосаркомы —
сопровождающиеся опухолевым ростом. К ним относятся лимфосаркома,
ретикулосаркома, лимфогрануломатоз и миеломная болезнь.

Возбудителем лейкоза
крупного рогатого скота является опухолеродный РНК-содержащий вирус
из семейства Retroviridae.

Источник возбудителя
инфекции — животное, зараженное ВЛКРС.

Факторами передачи
являются кровь, молоко и другие секреты и экскреты, содержащие
лимфоидные клетки, инфицированные ВЛКРС.

Заражение может
происходить при совместном содержании здоровых и инфицированных
ВЛКРС животных.

1.2. Диагностические
исследования на лейкоз проводят серологическими,
молекулярно-биологическим, гематологическим, клиническим,
патоморфологическим методами, методом биопробы.

1.3. Основу диагностики
лейкоза крупного рогатого скота составляет серологический метод
исследования — реакция диффузионной преципитации (РДП), иначе
называемая реакцией иммунодиффузии в геле агара (РИД).

Из числа положительно
реагирующих в РИД животных (инфицированных ВЛКРС) с помощью
гематологического метода выявляют больных лейкозом.

2.
Серологические методы диагностики лейкоза крупного рогатого
скота

2.1. Реакция
иммунодиффузии (РИД).

2.1.1. Сущность
метода.

Метод основан на
обнаружении в сыворотке крови животных специфических
преципитирующих антител к антигенам вируса лейкоза крупного
рогатого скота. Специфические антитела появляются в крови через 2-8
недель после заражения животного ВЛКРС и сохраняются в организме
пожизненно.

2.1.2. Серологическому
исследованию на лейкоз подвергают животных в возрасте 6 месяцев и
старше. Пробы крови для исследований берут не ранее чем через 30
суток после введения животным вакцин и аллергенов, у стельных
животных — за 30 суток до отела или через 30 суток после него.

2.1.3. Получение
сыворотки. Сыворотки для исследования получают из крови испытуемого
животного в количестве 2-3 мл и направляют в лабораторию с
сопроводительным документом, в котором указывают название
хозяйства, номер (кличку), возраст, пол, породу животного.

Кровь (для получения
сыворотки) берут в бактериологические пробирки, выдерживают 1-2 ч в
теплом месте (не выше 40°С). Для лучшего отделения сыворотки
образовавшийся сгусток обводят в пробирке профломбированной после
каждой пробы стальной спицей (проволокой). После этого пробирки
выдерживают в течение 20-24 ч при 4-10°С. Полученные пробы
сыворотки сливают в пробирки Флоринского (достаточно 2-3 мл) и
маркируют.

При невозможности
быстрого исследования подготовленные сыворотки хранят в
замороженном состоянии.

2.1.4. Для постановки РИД
используют набор для серологической диагностики лейкоза крупного
рогатого скота (ТУ 10-19-442-87), в состав которого входят: сухой
специфический антиген вируса лейкоза крупного рогатого скота,
состоящий из гликопротеидного gр-51 и полипептидного р-24
антигенов, разбавитель антигена, специфическая преципитирующая
сыворотка (СПС) к вирусу лейкоза, солевая смесь агара (ССА) и
разбавитель ССА, контрольные сыворотки: отрицательная,
положительная, слабоположительная и положительная с антителами к
р-24 антигену ВЛКРС.

Оборудование и
реактивы:


чашки Петри диаметром 100 мм;


стандартный штамп-пробойник для просечения лунок в агаре;


пипетки пастеровские или автоматические со сменными
наконечниками;


рН-метр;


осветитель;


хлорид натрия (х.ч.);


дистиллированная вода.

2.1.5. Постановка
РИД.

Подготовку компонентов
реакции к работе осуществляют в соответствии с «Наставлением по
применению набора для серологической диагностики лейкоза крупного
рогатого скота». Антиген растворяют в 5 см разбавителя. Растворенный антиген хранят
при температуре 4°С не более двух недель.

Разбавитель ССА и солевую
смесь агара переносят в колбу и приливают дистиллированную воду до
объема 200 см, затем колбу помещают в водяную баню и
выдерживают до полного расплавления гранул агара. Расплавленный
агаровый гель, имеющий температуру 50-70°С, разливают слоем 2-3 мм
(12-15 мл) в обезжиренные чашки Петри и оставляют их приоткрытыми
при комнатной температуре в течение 1 ч. После застывания агара
специальным штампом-пробойником делают лунки в геле, не допуская
образования трещин между ними и отслоения агара от дна чашки. В
каждой чашке делают по четыре фигуры, каждая из которых состоит из
семи лунок: одна в центре, остальные по периферии. Диаметр каждой
лунки составляет 7 мм, расстояние между центральной и
периферическими лунками — 3 мм. Образовавшиеся диски геля удаляют
из лунок канюлей, соединенных с вакуумным насосом.

Читайте также:  Как вылечить острый лейкоз

Антиген, контрольные и
испытуемые сыворотки вносят в лунки каждой фигуры пастеровскими или
автоматическими пипетками со сменными наконечниками.

Антиген (А) вносят в
центральную лунку, две диаметрально противоположные лунки заполняют
контрольной сывороткой (КС). Оставшиеся в фигуре 4 периферические
лунки (1, 2, 3, 4) заполняют испытуемыми сыворотками. Лунки
заполняют доверху, не допуская переливания жидкости через край.
После заполнения всех лунок чашки Петри закрывают крышками и
инкубируют во влажной камере при температуре 22-27°С.

2.1.6. Учет и оценка
результатов реакции.

2.1.6.1. Реакцию
учитывают не ранее чем через 48 ч и не позднее чем через 96 ч.
Чашки просматривают на темном фоне, направляя сфокусированный луч
осветителя на дно чашки под углом 30-45°. Специфичность реакции
оценивают по контрольной линии преципитата. Если она отсутствует
или слабо выражена, то реакцию следует повторить.

Специфическая линия
преципитации, формируемая преципитирующей контрольной сывороткой и
антигеном, должна быть четкой, иметь форму прямой, располагаться на
одинаковом расстоянии от лунок с антигеном и контрольной
сывороткой.

Неспецифической считают
линию преципитации, которая образуется между лунками с испытуемой
сывороткой и антигеном, но не сливается с контрольной линией
преципитации, а пересекает ее или упирается в нее, образуя
угол.

2.1.6.2. Оценка
результатов.

В
зависимости от наличия специфических антител против антигенов ВЛКРС
в испытуемой сыворотке реакцию оценивают как положительную или
отрицательную.

Положительной считают
реакцию, если между лунками с антигеном и испытуемой сывороткой
образуется полоса преципитации, которая соединяется с полосой
преципитации контрольной сыворотки, образуя непрерывную линию, то
есть идентична ей (рис.1 — не приводится, поз.1):


если линия преципитации между лунками с испытуемой сывороткой и
антигеном отсутствует, но контрольная линия преципитирующей
сыворотки образует вблизи лунки с испытуемой линией изгиб,
направленный в сторону лунки с антигеном (рис.1, поз.2), —
слабоположительная сыворотка;


если контрольная линия значительно укорочена со стороны лунки с
испытуемой сывороткой и имеет размытый изгиб к лунке с антигеном
или образует линию преципитации, расположенную очень близко от
лунки с антигеном (рис.1, поз.2), — резко положительная
сыворотка.

Положительно реагирующая
сыворотка может образовывать вторую линию преципитации, которая
располагается ближе к лунке с испытуемой сывороткой. Эта линия
указывает на наличие в сыворотке преципитирующих антител против
второго антигена (р-24) ВЛКРС (рис.1, поз.3).

При образовании толстой,
короткой, без загибов контрольной линии преципитации, не доходящей
до лунки с испытуемой сывороткой, необходимо провести раститровку
этой испытуемой сыворотки физраствором до получения результата,
который можно будет оценить как отрицательный, положительный или
неспецифический. Для этого необходимо физиологический раствор в
объеме 100-500 мкл разлить в пробирки или в лунки стандартных
пластиковых плат для постановки серологических реакций (количество
пробирок или лунок соответствует числу необходимых разведений). В
первую пробирку или лунку с физраствором внести такой же объем
сыворотки, тщательно перемешать и перенести той же пипеткой в том
же объеме в следующую пробирку или лунку, затем после перемешивания
— в следующую и т.д. В результате в первой пробирке или лунке
испытуемая сыворотка разведена в 2 раза, во второй — в 4 раза, в
третьей — в 8 раз и т.д.

Реакцию считают
отрицательной, если контрольная линия продолжается до лунки с
испытуемой сывороткой без загиба (рис.1, поз.4).

В
случаях, когда линия преципитации плохо просматривается или имеется
зона опалесценции вокруг лунок, реакцию следует переставить.

Сдвиг контрольной линии
преципитации в сторону лунки с антигеном или с контрольной
сывороткой указывает на нарушение соотношения антигена и антител в
тест-системе. В этом случае необходимо использовать другую серию
диагностического набора.

Читайте также:  Лейкоз крупного рогатого скота и меры профилактики

2.1.7. Животных,
сыворотки крови которых дали положительный результат в РИД,
признают зараженными вирусом лейкоза, и их необходимо исследовать
гематологическим методом.

2.2. Метод
иммуноферментного анализа (ИФА).

2.2.1. Сущность метода.
Иммуноферментный анализ основан на иммунохимической реакции
взаимодействия антиген-антитело и использовании в качестве
индикатора этой реакции маркированных ферментами антител или
антигенов.

Существует две
модификации иммуноферментного анализа: непрямой и конкурентный.

Метод непрямого
иммуноферментного анализа основан на связывании специфических к
вирусу лейкоза антител с антигеном ВЛКРС, адсорбированным на
стенках лунок планшета для микротитрования. Связавшиеся антитела
выявляют с помощью видоспецифических антител, меченых ферментом
(пероксидазой), с последующим ферментативным превращением
бесцветного субстрата пероксидазой в окрашенный продукт.
Интенсивность окраски прямо пропорциональна содержанию антител к
ВЛКРС в сыворотке крови.

В
основе конкурентного иммуноферментного анализа лежит способность
антител к ВЛКРС, содержащихся в испытуемой сыворотке, блокировать
связывание антигена ВЛКРС с антителами к ВЛКРС, иммобилизованными
(адсорбированными) на стенках лунок планшетов для микротитрования
(МТП). Антиген ВЛКРС, связавшийся с иммобилизованными антителами,
выявляют с помощью антител к ВЛКРС, меченных пероксидазой
(конъюгатом антител с пероксидазой) и последующего ферментативного
превращения бесцветного субстрата пероксидазы в окрашенный продукт.
В том случае, если испытуемый материал не содержал антител к ВЛКРС,
интенсивность окрашивания максимальна. Антитела к ВЛКРС в
испытуемом материале снижают интенсивность окрашивания прямо
пропорционально их содержанию.

2.2.2. Материалы и
оборудование.

2.2.2.1. Материалом для
исследования методом иммуноферментного анализа может служить
сыворотка крови, секрет вымени сухостойных коров, молозиво и
молоко.

При исследовании
сывороток крови их получают, как изложено в п.2.1.3. Сыворотки
пригодны для использования в течение 10 дней при температуре
хранения +4°С. Срок годности сыворотки, хранящейся при температуре
-20°С и ниже, не ограничен.

Бактериально
загрязненные, разложившиеся или сильно гемолизированные сыворотки
непригодны для исследования.

2.2.2.2. При постановке
реакции используют стандартные коммерческие диагностические наборы
согласно прилагаемому к ним наставлению по применению.

Для проведения
исследования применяют:


микропипетки одноканальные автоматические;


микропипетки 8- или 12-канальные автоматические;


фотометр одно- или многоканальный с автоматической регистрацией
результатов. Рекомендуется использовать анализатор иммуноферментный
фотоэлектрический АИФ-Ц-01С;


микротитровальные пластмассовые (полистироловые) планшеты с 96
лунками;


автоматическое или полуавтоматическое оборудование для промывания
пластин;


термостат, обеспечивающий температуру 37+/-0,5°С;


стаканы химические;


колбы мерные;


колбы Эрленмейера;


пробирки;


пипетки градуированные вместимостью 1 и 10 см.

2.2.3. Непрямой
иммуноферментный анализ для выявления антител к вирусу лейкоза.

2.2.3.1. В состав
диагностического набора входят:


антиген вируса лейкоза лиофилизированный и разбавитель
антигена;


конъюгат антител против иммуноглобулинов крупного рогатого скота с
пероксидазой или другим ферментом, жидкий или лиофилизированный, и
разбавитель конъюгата;


сыворотки контрольные — отрицательная и положительная
(слабоположительная), лиофилизированные или жидкие;


разбавитель для сывороток и промывающий раствор, содержащий
детергент и инертный белок;


субстрат ферментативной реакции;


микротитровальные полистироловые планшеты с 96 лунками.

2.2.3.2. Проведение
исследования.

Иммобилизация антигена
ВЛКРС. Содержимое флакона с антигеном растворяют в разбавителе для
антигена и вносят по 0,1 мл в лунки микротитровального планшета,
закрывают планшет крышкой и инкубируют в течение 18 ч при 4°С. В
состав некоторых коммерческих наборов для выявления антител к
вирусу лейкоза входят планшеты с иммобилизованным антигеном,
готовым к употреблению. Планшет трижды промывают промывающим
раствором, полностью заполняя лунки, и выдерживают раствор 1,5-2
мин. Тщательно удаляют раствор из лунок.

Готовят исходные
разведения испытуемых сывороток. С этой целью в пробирки наливают
по 3,9 мл разбавителя для сывороток и конъюгата, вносят по 0,1 мл
испытуемой сыворотки и перемешивают. Для каждой пробы используют
отдельный наконечник к автоматической пипетке.

Испытуемый материал в
исходном разведении вносят по 0,1 мл в две соседние лунки
микротитровальной пластины. Таким же способом вносят контрольные
положительную, слабоположительную и отрицательную сыворотки. На
каждом планшете оставляют лунки, заполненные только разбавителем
без сыворотки (холостая проба). Их расположение зависит от
конструкции фотометра и служит для установки «нуля» прибора.
Планшет закрывают крышкой и инкубируют при температуре 18-37°С во
влажной камере в течение 1-2 часов. Планшет трижды промывают
промывающим раствором.

В
лунки вносят по 0,1 мл раствора антивидового конъюгата, планшет
закрывают крышкой и инкубируют при температуре 20-37°С в течение
1-2 часов. Планшет трижды промывают промывающим раствором.

Читайте также:  Лейкоз анализ крови показатели у взрослых таблица

В
каждую лунку вносят по 0,1 мл раствора субстрата и инкубируют 0,5-1
час при комнатной температуре.

2.2.3.3. Оценка
результатов реакции.

Возможна визуальная и
инструментальная оценка результатов.

При визуальной оценке
результатов следует обратить внимание на цвет окраски. Он зависит
от того, какое вещество служит хромогеном в данном диагностическом
наборе. Например, если в состав субстратной смеси входит
5-аминосалициловая кислота, окраска должна быть
фиолетово-коричневой, если орто-фенилендиамин — оранжево-красной и
т.д. Появление окрашивания, не свойственного данному веществу,
обычно свидетельствует о плохом качестве воды, применяемой для
растворения компонентов реакции, и отрицательно сказывается на
чувствительности и специфичности реакции. Интенсивность окрашивания
одной и той же пробы в обеих лунках должна быть одинаковой.
Допускается незначительное фоновое окрашивание холостой пробы.
Интенсивность окрашивания отрицательного контроля должна
незначительно превышать интенсивность окрашивания холостой пробы.
Интенсивность окрашивания слабоположительного контроля должна быть
существенно выше, чем в отрицательном контроле. Положительный
контроль должен быть окрашен наиболее интенсивно. Испытуемую пробу
считают положительной, если интенсивность ее окрашивания больше или
равна интенсивности окрашивания слабоположительного контроля. Если
интенсивность окрашивания для двух параллельных исследований одной
пробы различается настолько, что затрудняет постановку диагноза, то
эту пробу исследуют повторно.

При инструментальной
оценке результатов реакции после визуальной оценки цвета и
правильности реагирования контрольных образцов оптическую плотность
продуктов реакции измеряют на фотометре при длине волны, указанной
в наставлении по применению данного диагностического набора.
Результаты оценивают по относительной величине (ОВ), которую
рассчитывают по формуле:

,

где:

ОП — средняя оптическая плотность испытуемой
пробы;

ОП — средняя оптическая плотность
отрицательного контроля;

ОП — средняя оптическая плотность холостой
пробы.

При установке «нуля
прибора» по холостой пробе формула упрощается:

.


Положительным считается
испытуемый материал, ОВ которого больше или равна 2,0.

Отрицательным считается
испытуемый материал, ОВ которого не превышает 1,49.

Испытуемый материал с ОВ
от 1,5 до 1,9 включительно считают сомнительным. Повторное
исследование сыворотки крови или пробы молока от этого животного
проводят через три месяца.

2.2.4. Конкурентный
иммуноферментный анализ для выявления антител к вирусу лейкоза.

2.2.4.1. В состав
диагностического набора входят:


антитела к ВЛКРС, адсорбированные в лунках МТП;


антиген вируса лейкоза;


конъюгат антител к ВЛКРС с пероксидазой или другим ферментом;


сыворотки контрольные — положительная, слабоположительная и
отрицательная;


разбавитель для сывороток и промывающий раствор, содержащий
детергент и инертный белок, предотвращающий неспецифическое
связывание;


субстрат ферментативной реакции;


микротитровальные полистироловые планшеты с 96 лунками.

2.2.4.2. Проведение
исследования.

Иммобилизация антител к
ВЛКРС. Содержимое флакона с антителами растворяют в разбавителе для
антител и вносят по 0,2 мл в лунки МТП, закрывают планшет крышкой и
инкубируют в течение 18 часов при температуре 4°С. В состав
некоторых коммерческих наборов для выявления антител к ВЛКРС могут
входить планшеты, готовые к употреблению. Планшет трижды промывают
промывающим раствором, полностью заполняя лунки и оставляя в них
раствор на 1,5-2 мин, тщательно удаляют раствор из лунок.

Испытуемый материал
(сыворотки крови или секрет молочной железы) вносят по 0,05 мл в
лунки МТП. Контрольные образцы вносят в двух повторностях. Затем во
все лунки вносят по 0,15 мл растворенного в разбавителе антигена,
перемешивают содержимое лунок, слегка постукивая по краю МТП,
закрывают МТП крышками и инкубируют во влажной камере 1,5-2 часа
при температуре от 18°С до 37°С. Следует строго соблюдать указанный
порядок внесения испытуемого материала и антигена в лунки. Планшет
трижды промывают промывающим раствором.

В
лунки вносят по 0,2 мл конъюгата, закрывают крышками и инкубируют
при температуре 18°С-37°С в течение 1,5-2 часов во влажной камере.
Планшет трижды промывают промывающим раствором.

В
каждую лунку вносят по 0,2 мл раствора субстрата ферментативной
реакции, инкубируют 0,5-1 час при комнатной температуре, в случае
необходимости останавливают реакцию добавлением специального
раствора и измеряют оптическую плотность в каждой лунке на
фотометре при длине волны, характерной для данного субстрата.

Источник